### 四环素类检测试剂盒使用说明书（酶联免疫法）

#### 1. 原理及用途

本试剂盒采用间接竞争ELISA（酶联免疫吸附测定）方法，用于检测组织、蜂蜜、鸡蛋等样本中的四环素类药物（Tetracyclines，TCs）。试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测过程中，加入标准品或样品溶液，样本中的四环素类药物与酶标板上的预包被偶联抗原竞争抗四环素类药物抗体，随后加入酶标记物，利用TMB底物显色。样本吸光度值与其所含四环素类药物的含量呈负相关，通过与标准曲线比较可得出样本中四环素类药物的残留量。

#### 2. 技术指标

**2.1 灵敏度:** 0.05 ppb (ng/ml)

**2.2 反应模式:** 37℃，30分钟

**2.3 检测下限:**
组织、肝脏、鸡蛋: 2 ppb
蜂蜜: 2 ppb
尿样: 0.5 ppb
牛奶: 2 ppb
奶粉: 4 ppb

**2.4 交叉反应率:**
四环素: 100%
强力霉素: 70%
金霉素: 10%
土霉素: 10%

**2.5 样本回收率:**
组织: 85 ± 20%
肝脏、鸡蛋: 75 ± 20%
蜂蜜: 85 ± 20%
尿样: 80 ± 20%
牛奶、奶粉: 75 ± 20%

#### 3. 试剂盒组成

酶标板: 96孔
高浓度标准品溶液 (1瓶): 100 ppb（高标准液有挥发性，需注意密封）
标准品溶液: 0 ppb、0.05 ppb、0.1 ppb、0.2 ppb、0.4 ppb、0.8 ppb（均为空瓶，现配现用）
酶标记物（红盖）: 1.1 ml
抗体工作液（蓝盖）: 5.5 ml
底物液A（白盖）: 6 ml
底物液B（黑盖）: 6 ml
终止液（黄盖）: 6 ml
20×浓缩洗涤液（白盖）: 40 ml
5×复溶液（黄盖）: 50 ml
说明书: 1份
盖板膜: 1张
自封袋: 1个

#### 4. 需要的器材和试剂

**4.1 仪器:** 酶标仪、打印机、均质器、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01 g）

**4.2 微量移液器:** 单道20µl-200µl，100µl-1000µl，多道300µl

**4.3 试剂:** 浓盐酸、无水甲醇

#### 5. 样本前处理

**5.1 样本处理前须知:** 所有实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。

**5.2 配液:**
配液1: 将5×复溶液用去离子水5倍稀释（1份5×复溶液加4份去离子水），用于样本复溶，在4℃保存可保留一个月。
配液2: 将浓缩洗涤液20倍稀释（1份洗涤液加19份去离子水）。
配液3: 将43ml浓盐酸与去离子水混合均匀，定容至50ml，再加入450ml无水甲醇。

**5.3 样本前处理步骤:**
**5.3.1 组织、肝脏、鸡蛋样本处理:**
1. 准确称取1±0.005g均质后的样本于离心管中，加入2ml样本提取液，剧烈振荡2分钟，以确保样本充分分散与有机相接触。
2. 室温下以4000转/分钟离心5分钟，取出50µl上层液体，注意不要取到表层的白色漂浮物，根据测量稀释.
3. 加入950ul复溶液混匀，并取50µl用于分析。样本稀释倍数：40，检测下限：2ppb。

**5.3.2 蜂蜜样本处理:**
1. 准确称取1±0.005g蜂蜜于离心管中，加入1ml样本提取液，振荡混匀2分钟。
2. 取出50µl混合液，加入950ul复溶液混匀，取50µl用于分析。样本稀释倍数：40，检测下限：2ppb。

**5.3.3 尿样处理:**
1. 用复溶液将尿样10倍稀释，并如有必要过滤或离心。
2. 取50µl稀释的尿样用于分析。样本稀释倍数：10，检测下限：0.5ppb。

**5.3.4 牛奶样本处理:**
1. 准确吸取1ml牛奶于离心管中，加入2ml样本提取液，振荡2分钟。
2. 离心并提取50µl上层液体混合950ul复溶液，取50µl用于分析。样本稀释倍数：40，检测下限：2ppb。

**5.3.5 奶粉样本处理:**
1. 准确称取1±0.005g奶粉，加入4ml样本提取液，振荡2分钟。
2. 离心并取50µl上层液体，混合950ul复溶液，取50µl用于分析。样本稀释倍数：80，检测下限：4ppb。

#### 6. 酶联免疫试验步骤

将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，放置室温平衡超过30分钟。在实验开始之前，需配制标准品应用液。标准液的配置需谨慎，以确保浓度稳定，并需立即使用。根据不同浓度标准液，依次加入复溶液并摇匀。

#### 7. 结果分析

标准液或样本的百分吸光率计算方式为，其值的平均值除以0 ppb的吸光度值，再乘以100%。绘制标准液的半对数曲线图，从标准曲线中获取样本浓度，并乘以稀释倍数得出实际浓度。

#### 8. 注意事项

室温低于25℃或试剂及样本未回到室温会导致测量偏差。洗板过程需迅速，确保孔内干净，混合要均匀。在整个实验过程中，应注意避免光线照射，以确保实验结果的可靠性。

#### 9. 贮藏及保存期

试剂盒应存放在2-8℃条件下，避免冷冻，保质期为一年，生产日期详见包装盒。

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