Z6·尊龙凯时细胞培养指南

培养条件

细胞培养所需的条件包括：DMEM培养基、10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素（P/S），并使用贴壁培养。培养温度设定为37℃。首次传代建议采用1:2的比例。更换培养基的时间为每两天。

细胞运输注意事项

建议同时购买完培，享受优惠。在接收细胞后，应立即进行处理，将其培养至良好状态后，使用完全培养液充满细胞瓶并封好瓶口，这是最佳的运输细胞方法。收到细胞后，应使用75%酒精对整个细胞瓶进行喷洒消毒，然后在超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5%CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态后再进行后续处理。

细胞观察与拍照

在显微镜下观察细胞的生长情况，并拍摄不同倍数的图像进行保存（建议40x、100x、200x各一张）。前三天的照片是重要的售后依据，未提供照片视为状态良好。

细胞培养步骤

a. 细胞传代

如果细胞汇合度未超过80%，将瓶装的完全培养液收集至离心管中，留5ml完全培养基，放入37℃、5%CO2孵箱中培养；当细胞密度超过80%时，即可进行传代。贴壁细胞传代的具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，放入37℃培养箱消化1-2分钟。显微镜下观察细胞，若多数细胞变圆并脱落，迅速回到操作台，轻轻敲打培养瓶后加上5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落并吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟，弃去上清液并补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），补充5-8ml的新完全培养基，最后置于37℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养。

b. 悬浮细胞传代步骤

1. 采用半换液法，倾斜培养瓶在培养箱静置1小时，轻轻吸掉约3ml的培养基，再补加3ml的完全培养基。如培养基变色缓慢，可直接添加约500ul的FBS，传代时直接补给5ml培养基并分为两个培养瓶，每约3次传代后可进行一次离心以去掉死细胞。
2. 采用离心换液法时，如需分瓶，将细胞悬液收集至离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml培养液后重悬混匀，最后按1:2的比例分至新T25瓶中，并添加6-8ml的新完全培养基以维持细胞生长活力。后续传代根据实际情况可按1:2至1:5的比例进行。

c. 细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%时，弃去T25培养瓶中的培养液，并用PBS洗涤细胞一次。
2. 添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，观察细胞回缩变圆后，加入5ml的完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使其脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清后，将细胞沉淀加入1ml雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱中，如需将其转入液氮罐，需在-80℃冰箱中存放24小时以上后再转入液氮罐中。

细胞复苏

1. 从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护面具），迅速置于37℃水浴中解冻，直至无结晶后，用75%酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，加入5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，并置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。
4. 第二天更换为新鲜的完全培养基继续培养。

注意事项

有些细胞可能在运输过程中脱落，这是正常现象。如细胞脱离较多，可将培养瓶内所有培养液收集至离心管中，1000RPM离心5分钟，收集上清进行过渡培养，随后用胰酶1-2ml处理并轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基终止反应，再进行离心和重悬。最终按1:2的比例分瓶传代（两个T25），并补充新的完全培养基至5-8ml每瓶，最后放入37℃、5%CO2细胞培养箱培养。通过Z6·尊龙凯时的指导，确保您能够高效、安全地完成细胞培养的每一步。