当科研同事讨论他们珍贵的RNA样品时，我们常常听到“把那根试管放在冰上！！”和“我希望它不会降解”。RNA的稳定性本质上不如分子生物学中使用的大多数大分子（如DNA或蛋白质）。因此，CRISPR/Cas9实验中使用的RNA（即“gRNA”）同样面临“易碎”的问题。

为了应对这一挑战，研究表明gRNA可以通过化学修饰来增强其抵抗降解的能力，同时仍然能够有效引导Cas9进行靶向断裂。这些gRNA技术的进展不仅增强了靶向效果，还减轻了对RNA稳定性的顾虑。一些gRNA的修饰甚至不仅提高了稳定性，还增加了“色彩”或改变了“开关”机制。

稳定的gRNA修饰通常涉及对磷酸糖骨架的修饰，gRNA引导大约20nt的CRISPR/Cas9靶向识别序列，这部分来自于较大的CRISPR RNA（crRNA）。除了20nt的引导序列外，crRNA的3'末端还有一个约20nt的重复区域。此重复区域与Cas9蛋白的转录激活crRNA（tracrRNA）相互作用。这些RNA分子易受到细胞质和核酸酶的攻击，因其会被识别为外源RNA。

为了保护RNA不被降解，现有几种简单的方法可以修饰RNA的糖或磷酸分子以提高其稳定性。自然界早已进化出多种机制来防止重要细胞RNA分子通过翻译后修饰而降解。其中，最常见的修饰是2'-O-甲基化，即在核糖的2'羟基上添加甲基，以此保护其免受核酸酶的侵袭。另一种稳定的修饰是2'-氟（2'-F），它将2'位置的羟基替换为氟。

移动糖环中的位置，3'-硫代磷酸酯键也是一种流行的稳定修饰，其中硫取代了非桥接的磷酸氧。其他有助于稳定RNA的骨架修饰还包括酰胺键、锁核酸和受限的乙基。哪种RNA骨架修饰表现最佳呢？研究显示，将多种修饰联用，例如硫代磷酸酯与2'-O-甲基修饰结合，通常比单一修饰更为稳定。

这些改良可以通过市售试剂盒在实验室中完成，也可以在购买gRNA时作为合成修饰添加。修饰通常会集中在crRNA分子的末端（通常前3nt中的1-3个被修饰）以实现最佳的稳定性和有效性。更进一步，若将一些核糖核苷酸替换成脱氧核苷酸，可以在预算内提升gRNA的效率。含有部分DNA的gRNA对Cas9蛋白展现出意外的耐受性，同时也能提高靶向效率。

此外，锁核酸或桥接核酸也可以有效地引入gRNA中。这些修饰能够限制RNA的构象，增强错配鉴别能力与核酸酶抗性，从而减少脱靶现象。虽然这两者有相似的优点，但N-甲基取代的桥接核酸在哺乳动物细胞中的效率稍高且毒性更小。

值得注意的是，上述一些RNA稳定修饰是在CRISPR/Cas9之前针对siRNA和反义寡核苷酸等应用开发的，特别是一些不含5'-三磷酸盐的合成修饰，能够显著降低与gRNA引入相关的先天免疫反应。这一点在研究外源RNA引入对细胞活性影响及免疫力的实验中尤为关键。

关于gRNA的“开关”功能，目前的进展已经开发出可光激活和可光切割的gRNA，以解决相关问题。这通过在gRNA的20nt靶向区域引入单个可光切割的2-硝基苄基接头实现。这样的gRNA在适当光源下暴露不到一分钟后便会被裂解，失去效用。光激活的系统则通过光笼技术阻止gRNA与靶序列结合，经过短暂光照后，gRNA被释放，CRISPR/Cas9系统能够启动靶向编辑过程。这两种技术均利用了对RNA的化学修饰，并可以通过简单的LED灯进行控制。

在靶向实验中，对gRNA进行染料标记可帮助您可视化转染效率，甚至可以在细胞实验中追踪定位。市场上有许多合适的染料可供选择，您可以选择自己动手使用试剂盒，或购买带有标签的商业合成染料。如果您还在为选择而犹豫，不妨为crRNA或tracrRNA染色标记。当然，在单个向导系统中（即crRNA和tracrRNA组合成一个分子）您可能不需要该方案，但还是有多个染色标记可供选择。

在CRISPR/Cas9这一实验模块中，相信您的学习已经逐渐深入。如果您需要与Cas蛋白相关的原材料，强烈推荐Z6·尊龙凯时即将推出的CRISPR/Cas系列蛋白产品，期待您与我们相遇。